Konuyu Oyla:
  • Toplam: 1 Oy - Ortalama: 5
  • 1
  • 2
  • 3
  • 4
  • 5
Agaroz Jel Elektroforezi
#1
Bir hedef DNA bölgesinden birçok kopya çıkararak, bir PCR reaksiyonu veya bir DNA klonlaması yaptınız ve bir geni dairesel bir DNA plazmidine "yapıştırmaya" çalıştınız. Şimdi PCR'ınızın işe yarayıp yaramadığını veya plasmidinizin içinde genin eklenmiş olup olmadığını kontrol etmek istersiniz. Bunun için uygulanacak en kolay ve ucuz yöntem jel elektroforezi yöntemidir.

Jel elektroforezi, DNA parçalarını veya RNA ve proteinler gibi diğer makromolekülleri boyut ve yüklerine göre ayırmak için kullanılan bir tekniktir. Elektroforezde ilgili molekülleri içeren bir jele bir akım uygulanır. Böylece moleküllerin boyutları ve yükleri temel alınarak farklı yönlerde veya farklı hızlarda jelden geçmeleri suretiyle birbirlerinden ayrılmaları sağlanır.

Tüm DNA moleküllerinin kütle başına aynı miktarda yükü vardır. Bu nedenle DNA parçalarının jel elektroforezi onları yalnızca boyuta göre ayırır. Elektroforez kullanarak bir numunede kaç farklı DNA parçasının bulunduğunu ve birbirlerine göre ne büyüklükte olduklarını görebiliriz. Ayrıca bir DNA parçasının mutlak boyutunu, bilinen boyuttaki DNA parçacıklarından oluşan standart bir "ölçüt" işaretinin yanında inceleyerek belirleyebiliriz. Kullanılan bu standartlar DNA marker ya da DNA ladder olarak bilinirler.

Adından da anlaşılacağı üzere, jel elektroforezi bir jel içerir. DNA ayrıştırması için jeller genellikle agaroz adı verilen , kuru, toz haline getirilmiş bir polisakaritten üretilir . Agaroz bir tamponda ( genellikle TAE ve TBE isimleriyle kısaltılan çözeltiler içerisinde ) ısıtılıp soğutulduğunda, katı bir jel oluşturacaktır. Moleküler düzeyde, jel hidrojen bağlarıyla bir arada tutulan ve küçük gözenekler oluşturan bir agaroz molekül matrisidir. DNA ayrıştırmaları için en çok kütle/hacimce %1 veya %2 lik agoroz karışımları kullanılır.

Jelin bir ucunda, DNA numunelerinin yerleştirileceği kuyucuk adı verilen cep benzeri girintiler bulunur. DNA örnekleri uygun derisimde yukleme boyalarıyla karıştırılarak bu kuyucuklara yüklenirler. Ancak yükeleme yapılmadan önce jel, içerisinde yine TAE ve TBE gibi bir tampon bulunduran bir tank içerisine yerleştirilir. Tankın bir ucu pozitif bir elektrota bağlanırken diğer ucu negatif bir elektrota bağlanır. Bu elektrotlara güç uygulandığında şeker fosfat omurgasındaki fosfat grupları nedeniyle negatif yüke sahip olan DNA eksiden artıya doğru jel boyunca hareket etmeye başlar. Bu hareket sırasında daha uzun yani molar ağırlığı daha yüksek DNA parçacıkları arkada kalırken görece kısa DNA parçacıkları öne geçerek jelin sonuna daha çabuk ulaşacaklardır. Moleküllerin ağırlıklarına bağlı olarak hızlarında oluşacak bu farklılık onların birbirinden ayrılmalarını sağlayacaktır. Elektrotlara uygulanacak olan güç akım veya gerilim değerleriyle belirlenebilir, bir çok laboratuvarlarda DNA ayrıştırması için 100 V gerilim uygulanır.
 
Parçacıklar ayrıldıktan sonra, jeli inceleyebilmek için bir DNA bağlayıcı boyaya ve  onu görünür kılacak UV ışığa ihtiyaç duyulur. Laboratuarlarda en çok kullanılan boya etidyum bromürdür. Etidyum bromür DNA ya bağlanma özelliği dolasıyla mutajenik bir ajan olarak kabul edilir ve teması kesinlikle engellenmelidir. Laboratuvarda etidyum bromür kullanmanın alternatifleri vardır. Örneğin, bazı araştırmacılar SYBR-temelli boyalar kullanırlar. SYBR boyalarının EtBr'den daha az kanserojenik olduğu, boyamanın daha duyarlı ve yüksek kontrastlı olduğu bulunmuştur. Ancak, bu boyaların DMSO içinde çözülmesi gerekir, bu çözücü ise kolaylıkla deriye nüfuz eder. EtBr'nin dezavantajlarına rağmen çoğu araştırmacı daha ucuz olduğu için EtBr kullanmayı tercih eder.  

Etidyum bromür jel hazırlanırken direk olarak karışıma eklenebileceği gibi, etidyum bromür ile boyama elektroforez işlemi sonunda jelin içine konulacağı bir çözelti yardımıyla da gerçekleştirilebilir.

Boyama işleminden sonra jel UV ışık altında fotoğraf çekebilen bir system içerisine yerleştirilir. UV nin zararlı etkilerinden dolayı bu ışık yakıldığında jele çıplak göz ile bakılmamalıdır. Başarılı bir ayrıştırma işlemi sonunda bu aşamada üzerinde birbirinden ayrı bantlar görünen bir fotoğraf elde edilir. Yüklenen örneklerde görülen bantlar DNA markerindaki bantların boyutlarıyla karşılaştırılarak deneyin başarısı hakkında daha gerçekçi bir yorum yapılabilir.
 
Ara
Cevapla


Hızlı Menü:


Konuyu Okuyanlar: 1 Ziyaretçi